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本制品是一种基于WST-8的显色反应，通过比色法检测细胞毒性时释放的乳酸脱氢酶(LDH)活性或检测其它样品中的LDH活性的试剂盒。和INT法相比，通常检测灵敏度更高，吸光度变化更大，检测结果更准确。

本试剂盒反应更灵敏，使用更方便。本试剂盒中的试剂对细胞无损害，所以使用本试剂盒时无须去除细胞培养液，可直接把检测工作液添加到细胞培养孔中，可以称为一步法；也可以取细胞培养液进行检测，可以称为无损法，细胞可以用于其它实验。

• 本试剂盒可检测细胞培养液、细胞裂解液等样品中LDH的活性。
  
• 本试剂盒既可以检测D-LDH，也可以检测L-LDH，或两者的混合物。
  
• 本试剂盒可以用于常规的乳酸脱氢酶活性的检测，更常用于以LDH释放为指标的细胞毒性检测。同时，基于细胞总乳酸脱氢酶活性的检测，本试剂盒也可以用于检测细胞增殖。

乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)是绝大部分哺乳动物活细胞中都存在的酶，广泛存在于哺乳动物各个组织中，以心、骨骼肌和肾脏通常最为丰富，是临床心肌酶谱检查中的一项重要指标，可用于心肌疾病的辅助诊断。LDH催化乳酸(Lactate)生成丙酮酸(Pyruvate)，同时伴随着NAD+到NADH的转化。由于其常在组织损伤期间释放(通常因为细胞膜失去完整性而导致细胞内LDH的释放)，因此也被视作细胞坏死和常见损伤和相关疾病的生物标志物。

细胞坏死(Necrosis)或者细胞凋亡(Apoptosis)的继发性坏死(Secondary necrosis)、焦亡(Pyroptosis)等造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞内的酶释放至细胞外，其中包括酶活性较为稳定的LDH。如果是培养的细胞就会释放到培养液里；如果是活体动物就会释放到组织微环境并很可能进入血液。对于培养的细胞，通过检测从质膜破裂的细胞中释放出来的LDH的活性，就可以实现对细胞毒性的定量分析。LDH释放被认为是细胞膜完整性的重要指标，并被广泛用于细胞毒性检测。LDH释放被认为是以前使用放射性的51Cr标记细胞，随后通过51Cr释放进行细胞膜完整性检测的安全有效的替代方法。

LDH活性有多种比色测定方法如DNP法、INT法、WST-8法等。DNP法即2,4-二硝基苯肼法，其原理是LDH催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸和2,4-二硝基苯肼反应，生成二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，其颜色深浅与LDH量成正比。DNP法步骤较为繁琐，一般较为少用。INT法，如细胞毒性检测试剂盒，是基于在LDH的作用下，NAD+被还原生成NADH，NADH和INT被硫辛酰胺脱氢酶(Diaphorase)催化反应生成NAD⁺和强生色物Formazan。

在LDH的作用下，NAD+被还原生成NADH，NADH和WST-8反应生成NAD+和水溶性的Formazan染料，在450nm波长下产生吸收峰，从而可以通过比色来定量LDH的活性。吸光度与LDH活性成线性正相关。该酶联反应原理的示意图如下。

• 试剂盒解冻后可以短期4℃存放，2～3天内有效。
  
• 冷冻会使样品中部分乳酸脱氢酶失活，样品在4℃可放置2～3天。建议样品准备好后尽量当天完成测定。
  
• 在检测细胞培养液中的乳酸脱氢酶时，由于血清含有乳酸脱氢酶，使用含血清的培养液会增加背景读数，在检测时一定要设置没有细胞，但加入了相同体积培养液的对照孔，以用于消除背景。血清含量越高，背景值越高。如果对于实验无明显影响，建议使用灭活血清，这样血清中的乳酸脱氢酶会被很大程度上失活，大幅降低背景。如果对于实验无明显影响，实验时可以使用无血清培养液或血清浓度较低的培养液，这样能有效降低血清中乳酸脱氢酶的本底活性。
  
• 细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大，都会造成细胞释放乳酸脱氢酶增加。此外，不同的细胞乳酸脱氢酶的含量也存在一定差异。
  
• 未加终止液时，随着时间延长，吸光值会逐渐增大。加入终止液后，显色可以稳定保存48小时。
  
• 如果希望进行乳酸脱氢酶活性的绝对定量，用户需自备乳酸脱氢酶标准品。

• 试剂盒的准备工作：
  LDH检测工作液的配制：按照每个检测反应100μL的体积配制适量的LDH检测工作液。均匀混合91μL检测缓冲液(Detection assay buffer)和9μL显色液(Chromogen solution)，即可配制成100μL LDH检测工作液。根据待检测样品(包括对照)的数量，配制适量的LDH检测工作液，具体配制方法参考下表。配制好的LDH检测工作液可以4℃存放3天，现配现用效果更佳。配制和使用过程中均要注意适当避光。
  

  成分	样本数
  	1	10	20	50
  Detection assay buffer	91μL	910μL	1820μL	4550μL
  Chromogen solution	9μL	90μL	180μL	450μL
  LDH检测工作液	100μL	1mL	2mL	5mL

• LDH标准曲线的制作(选做)：如果希望进行LDH酶活性的绝对定量，需自备LDH标准品(D-LDH、L-LDH或LDH皆可)，并新鲜配制不同浓度LDH标准品，如0、65、125、250、500、1000mU/ml等。如有必要，在后续实验中可以根据样品的LDH活性，对标准曲线的浓度范围进行适当调整。
  
• 检测细胞数的确定(选做)：通常按照常规的细胞接种量进行接种即可。但由于每种细胞的LDH量有所差异，为了得到最好的显色效果，可以通过预实验确定最适细胞数。
  
  • 收集细胞，用培养液洗涤细胞后配制成每毫升20万个细胞的细胞悬液，取0、12.5、25、50、100μL细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，即每孔细胞数为0、2500、5000、10000、20000个。分两组，一组是总LDH组(Total LDH)、一组是未处理对照组(Untreated control)，每个细胞浓度3个重复，过夜培养。
    
  • 37℃继续培养一定时间(与正式实验中的药物处理时间一致)。总LDH组各孔加入10μL LDH释放试剂，未处理对照组各孔加入10μL培养液。混匀，室温(约25℃)避光孵育15分钟。
    
  • 每孔加入100μL LDH检测工作液。混匀，室温(约25℃)避光孵育0～30分钟，由于不同细胞差异较大，建议首次实验时，分别测定0、5、10、20、30分钟时的吸光度，以便确定最佳反应时间。此时可用铝箔避光包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动。孵育完毕后在450nm处测定吸光度。如无450nm滤光片，可以使用420～480nm的滤光片。可以选择设定600nm(或600nm以上，如650nm)作为参比波长(也称参考波长)。450nm吸光度的读数减去参比波长的吸光度读数即可作为实测读数(A₄₅₀)。测试总LDH读数不超过但邻近酶标仪吸光度检测上限的细胞密度及孵育时间，即为最适细胞数和最适测试时间。
    
    
    
    图2.本试剂盒对A₅₄₉细胞的检测效果图。使用本试剂盒检测不同细胞数量的A₅₄₉细胞(含10% FBS培养液)，孵育时间为15分钟。总LDH组吸光度如图所示。实际检测数据会因检测仪器、实验条件等的不同而存在差异，本图仅供参考。
• 细胞毒性样品的准备：
  
  • 按照下表设置各实验组别，将适量细胞接种到96孔板中，过夜培养。按照下表中各组别处理方法更换培养液。
    
    为确保实验有效性，建议每个组别设置三个复孔。
    
    

    Groups	Method	Note
    未处理对照(Untreated control)	更换100μL的新鲜培养液	含细胞
    背景对照(Background control)	更换100μL的新鲜培养液	不含细胞①
    总LDH(Total LDH)	更换100μL的新鲜培养液	含细胞
    总LDH背景(Background of total LDH)	更换100μL的新鲜培养液	不含细胞①
    样品(Sample)②	更换100μL含药培养液③	含细胞
    样品背景(Background of Sample)	更换100μL含药培养液③	不含细胞①
    阳性对照(Positive Control)(选做，如步骤2)	更换100μL适当稀释后的LDH标准品③

    • 为了避免培养液中的血清、药物、LDH释放试剂对读数的影响，需设置不含细胞、但加入了相同培养液的组，用于消除背景。
      
    • 样品组也可以是仅用于乳酸脱氢酶检测的样品。
      
    • 含药培养液：根据实验需要，在新鲜培养液中加入药物(例如加入0～5μL特定的药物)。可设置不同浓度，不同处理时间。
  • 到达药物处理的预定时间后，总LDH组和总LDH背景组加入10μL的LDH释放试剂，其它组加入10μL的培养液。混匀，室温(约25℃)避光孵育15分钟。
• 吸光度测定：
  
  • 如果样品组细胞无其它用途，可以直接在每孔中加入100μL LDH检测工作液。如果样品组细胞还有其它用途，可直接取各孔的上清液100μL，或将培养板用多孔板离心机400×g室温离心5分钟，分别取各孔的上清液100μL。然后加入到一个新的96孔板中，接着加入100μL LDH检测工作液。
    
  • 混匀，室温(约25℃)避光孵育10～30分钟，孵育的最佳时间可以通过步骤3的预实验确定。孵育时可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动。
    
  • 在每个孔中加入20μL终止液，混匀，然后在450nm处测定吸光度。如无450nm滤光片，可以使用420～480nm的滤光片。可以选择设定600nm(或600nm以上，如650nm)作为参比波长(也称参考波长)，450nm吸光度的读数扣除参比波长的吸光度读数即可作为实测读数(A₄₅₀)。
    
    为确保检测效果，可以不添加终止液，在不同时间点测定吸光度，直到获得比较理想的吸光度数据为止，然后再酌情添加终止液。
    
    
  • 取各组复孔的平均值计算各组别吸光度。
    
    样品组吸光度＝A450_样品－A450_样品背景
    
    
    总LDH组吸光度＝A450_总LDH－A450_总LDH背景
    
    
    未处理对照组吸光度= A450_{未处理对照} - A450_{空白对照背景}
    
    

    细胞毒性或死亡率＝	样品组吸光度－未处理对照组吸光度	×100%
    	总LDH组吸光度－未处理对照组吸光度

    
    
  • 可绘制细胞毒性曲线：纵坐标为样品组吸光度，横坐标为药物浓度；据此可计算该药物作用特定时间的半致死剂量LD₅₀。
    
  • 若需准确计算出LDH酶活性的绝对活性，可通过一系列LDH标准品及相应测得的吸光度值绘制标准曲线，通过标准曲线相应公式计算出样品中LDH的酶活性。各孔数值减去背景对照后，以检测的吸光度(OD₄₅₀)为纵坐标，LDH酶活力(mU)为横坐标，绘制LDH标准曲线，如图3所示。同时计算出该趋势线的公式，这样就可以计算出样品中的LDH酶活力了。
    
    
    
    图3.本试剂盒对LDH标准品的检测结果。实际检测数据会因检测仪器、实验条件等的不同而存在差异，本图仅供参考。
    
    A_450nm＝k×LDH酶活力单位(mU)＋b
    
    通过Excel等软件计算出趋势线的斜率k和截距b。
    根据上述公式计算样品中LDH活力。
    
    检测体系中样品LDH酶活力单位(mU)＝(样品组吸光度－b)/k
    
    
    样品中LDH酶活力(mU/mL)＝检测体系中LDH酶活力单位(mU)/检测样品体积